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討論拐棗多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖血脂的影響
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)及其并發(fā)癥已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大常見(jiàn)病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告，全世界目前約有1.5 億DM 患者，預(yù)測(cè)2025 年將上升到3億，近年糖尿病以及多種并發(fā)病的發(fā)生率越來(lái)越高，對(duì)糖尿病的研究也隨著成為研究熱點(diǎn)。糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展與整體血糖水平的升高有密切的關(guān)系，同時(shí)糖尿病長(zhǎng)時(shí)間的高糖環(huán)境會(huì)引起糖脂代謝的紊亂引起臟器病變引起并發(fā)癥。血液中糖化血紅蛋白(HbAlc)與血糖濃度成正比，所以檢測(cè)血中HbAlc 水平可以直觀的反映出血糖水平，更好地監(jiān)測(cè)機(jī)體糖代謝的情況[4]。國(guó)外有學(xué)者研究證實(shí)了HbA1c是診斷血糖水平的重要指標(biāo)，而且HbA1c 與空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)低密度脂蛋白(LDL)呈正相關(guān)。在控制血糖水平的同時(shí)，有效調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂對(duì)治療糖尿病及其并發(fā)癥有重要意義。植物多糖在自然界中廣泛存在，具有降血糖、提高免疫力、防止心肌缺血等復(fù)雜的生物活性與功能，主要能促進(jìn)胰島素分泌，提高血漿胰島素水平，抑制糖異生途徑和調(diào)控糖原的合成、分解及促進(jìn)血糖利用。目前，市場(chǎng)上治療糖尿病的藥物主要是化學(xué)合成藥，雖然短期療效顯著，但常伴有不同程度的副作用，如心血管疾病、過(guò)敏反應(yīng)等。
拐棗(Hovenia acerba Lindl.) 俗稱萬(wàn)壽果屬鼠李科枳椇屬落葉喬木，因其果梗肉質(zhì)膨大扭曲，肉質(zhì)肥厚形似雞爪，味甘甜如棗，故名拐棗。營(yíng)養(yǎng)豐富，清涼利尿，解酒醉不醒，可治風(fēng)濕，有清熱利尿、止渴降火和解毒之功效，果梗性甘平有健胃補(bǔ)血的作用，主治頭風(fēng)、潤(rùn)五臟、利大小便，在甘肅省隴南市徽成盆地廣為栽培，產(chǎn)量很高。拐棗多糖(Hovenia acerbaLindl. Polysaccharides，HAP)系其主要有效成分，可治腋下狐臭和痔瘡，同其它藥用植物多糖一樣復(fù)雜的生物活性與功能，而拐棗多糖在降血糖、血脂方面的研究較少。為此，本文采用ALX 誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型來(lái)研究拐棗多糖作用于化學(xué)性糖尿病小鼠模型，觀察拐棗多糖對(duì)糖尿病小鼠的降血糖和降血脂作用效果，來(lái)開(kāi)發(fā)無(wú)毒無(wú)副作用的降糖替代藥物，對(duì)拐棗多糖綜合開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)，促進(jìn)拐棗產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重大意義。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物
拐棗采自甘肅省隴南市成縣支旗鎮(zhèn)梁旗村;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料均購(gòu)自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼料。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品
四氧嘧啶，Sigma 公司;鹽酸二甲雙胍片，上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn);格列苯脲片，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn);血糖試紙，愛(ài)奧樂(lè)醫(yī)療器械(深圳)有限公司;普魯卡因腎上腺素注射液，遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國(guó))有限公司生產(chǎn)。
1.1.3 主要儀器RE52AA
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海千載科技有限公司;TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV759 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;TDL-5000B 型低速冷凍大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;LGJ-18 型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;全自動(dòng)生化分析儀AU5800，貝克曼庫(kù)爾特有限公司;全自動(dòng)血糖檢測(cè)儀，愛(ài)奧樂(lè)醫(yī)療器械(深圳)有限公司;LC-6A 高壓液相色譜儀(配有 RI-10A 示差折光檢測(cè)器、7725i 手動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10AS 柱溫箱、CBM-20A 在線控制器和LC-solution 分析軟件)，日本島津公司;TSK-Gel SW3000 和TSK-Gel SW4000 色譜柱，日本 Tosoh 公司等。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 拐棗多糖的提取
將拐棗在 50 ℃ 烘干后將其粉碎，用無(wú)水乙醇回流脫脂，50 ℃烘干，取100 g 然后加入一定量的1000ml 蒸餾水，在40 ℃溫度下溶解2 h 后，真空抽濾所得上清液經(jīng)過(guò)減壓濃縮得濃縮液，與 Sevag 試劑(氯仿:正丁醇體積比4:1)按體積比5:1 混合，振蕩，離心棄去變性蛋白，重復(fù)4 次。合并水層，用 95% 的乙醇沉淀(體積比3:1)，5000 r/min 離心10 min，沉淀物溶于40 ℃熱水中，攪拌狀態(tài)下慢慢加入斐林試劑，析出銅絡(luò)合物，靜置1 h，傾出上清液，用水洗滌3 次，離心分離得絡(luò)合物，向絡(luò)合物中加4 ℃蒸餾水，再滴加 0.5 mol/L HCl 使之全部溶解，用 95% 的乙醇沉淀(體積比3:1)，離心，所得絮狀物分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得潔白拐棗多糖粉末。
1.2.2 拐棗多糖對(duì)正常小鼠血糖水平的影響
取 KM 小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組。按250 mg/kgbw 劑量每天灌胃一次二甲雙胍為藥物對(duì)照組;按照100 mg/kgbw、200 mg/kgbw、400 mg/kgbw 標(biāo)準(zhǔn)每天灌胃一次拐棗多糖，建立拐棗多糖低、中、高劑量組。在實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由飲食和飲水，以喂食與格列本脲對(duì)照組相同體積的生理鹽水為空白組，給藥后1 h 眼眶靜脈叢采血，用血糖儀測(cè)定FBG和稱量體重。
1.2.3 拐棗多糖對(duì)正常小鼠糖耐量的影響
取 KM 小鼠60 只，隨機(jī)分為6 組，設(shè)二甲雙胍對(duì)照組，拐棗多糖低、中、高劑量組，以喂食與格列本脲對(duì)照組相同體積的生理鹽水為空白組，各組灌胃給藥方法依照1.2.2，每天按10%葡萄糖20 mL/10 kgbw 灌胃一次為葡萄糖對(duì)照組，末次給藥前禁食12 h，給藥后30 min 眼眶采血測(cè)定0 h、0.5 h、1 h、2 h 各組小鼠的FBG。
1.2.4 拐棗多糖對(duì)腎上腺素引起高血糖小鼠血
糖水平的影響取 KM 小鼠60 只，隨機(jī)分成6 組，分組及給藥方法同1.2.2，每天按0.2 mg/kg bw 的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射一次腎上腺素，為腎上腺素為對(duì)照組。末次給藥前禁食__ 12 h，給藥30 min 后眼眶采血測(cè)定FBG。
1.2.5 糖尿病小鼠模型建立
取 KM 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在禁食不禁水12 h，稱重后，測(cè)量FBG。隨機(jī)取10 只小鼠作為正常對(duì)照組，將其余60 只小鼠腹腔一次性注射240 mg/kg bw新鮮配制的3% ALX 溶液，72 h 后眼眶靜脈叢采血，用血糖儀測(cè)定FBG，將FBG11.0 mmol/L 者視為造模成功。正常對(duì)照組每天灌胃一次與造模成功后的小鼠糖尿病模型組等體積的生理鹽水;按250 mg/kg bw劑量每天灌胃一次二甲雙胍為藥物對(duì)照組;按照100mg/kg bw、200 mg/kg bw、400 mg/kg bw 標(biāo)準(zhǔn)每天灌胃一次拐棗多糖，建立拐棗多糖低、中、高劑量組。在實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由飲食和飲水，連續(xù)觀察28 d，每隔7 d，測(cè)定FBG 和稱量體重，測(cè)定FBG 前12 h禁食不禁水。1.2.6 小鼠口服(灌胃)急性毒性預(yù)試驗(yàn)選取 50 只KM 小鼠，隨機(jī)分成5 組，一組小鼠為空白對(duì)照組。試驗(yàn)組小鼠進(jìn)行灌服，灌服劑量分別為10000、20000、40000、60000 mg/kg bw，給藥后籠邊觀察。先觀察30 min，在給藥后的4 h 再觀察1次，以后每天早晚各觀察1 次，連續(xù)觀察7 d。觀察的主要內(nèi)容有被毛組織光滑度、眼角膜是否有血絲、紅腫現(xiàn)象、小鼠活動(dòng)是否有異常行為，以及對(duì)小鼠進(jìn)行剖檢觀察各組織器官的變化。
1.3 檢測(cè)指標(biāo)
按照1.2.2方法給藥處理后，各組小鼠禁食不禁水12 h，采用血糖儀和血糖試紙，剪尾取血測(cè)各組小鼠FBG;測(cè)定FBG后，迅速處死動(dòng)物并解剖在靜脈血管采血，離心收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)TC、TG、HDL和LDL水平，取主動(dòng)脈頂端1 cm，10% 甲醛溶液分別固定24 h，常規(guī)石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，觀察組織形態(tài)學(xué)改變。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以xs 表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理，p0.05 為差異顯著，p0.01 為差異極顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 拐棗多糖對(duì)正常小鼠血糖水平的影響
格列本脲是降低血糖的特效藥物之一，由于其能刺激胰腺分泌胰島素而降低血糖，還通過(guò)增加門靜脈胰島素水平或?qū)Ω闻K直接作用，抑制肝糖原分解和糖原異生作用，也可增加胰外組織對(duì)胰島素的敏感性和糖的利用，而緩解人體高糖環(huán)境，所以醫(yī)療使用范圍較廣。格列本脲灌胃小鼠后血糖降低明顯，而拐棗多糖低、中、高劑量組在灌胃處理小鼠后血糖均發(fā)生了降低。連續(xù)灌胃7 d 后三種劑量組與空白組比較降血糖作用不存在顯著性的差異(p0.05)，高劑量的多糖作用下血糖濃度為5.09 mmol/L，空白對(duì)照此時(shí)血糖為5.19 mmol/L;三種多糖劑量組與格列苯脲組相比不及格列苯脲對(duì)正常小鼠血糖的影響，血糖濃度為3.39 mmol/L。研究結(jié)果表明，連續(xù)7 d 灌胃給予多糖，對(duì)正常小鼠的空腹血糖無(wú)顯著影響，可能無(wú)刺激正常胰島素分泌的作用。
2.2 拐棗多糖對(duì)正常小鼠葡萄糖耐量的影響
對(duì)各組小鼠灌胃給予葡萄糖后血糖開(kāi)始升高，葡萄糖組在1 h后達(dá)到最高峰，拐棗多糖低、中劑量組對(duì)葡萄糖致高血糖有明顯的抑制作用，使血糖值高峰提前到0.5 h，血糖分別為10.73和11.26 mmol/L，而1 h后，二甲雙胍組的血糖為5.79 mmol/L，高劑量的多糖灌胃后小鼠血糖為5.83 mmol/L，兩者在小鼠血糖降低作用上表現(xiàn)的非常顯著(p0.01)，這說(shuō)明拐棗多糖對(duì)正常小鼠口服葡萄糖耐量有明顯的改善作用，但不及二甲雙胍組。當(dāng)正常小鼠灌胃一定量外源性葡萄糖時(shí)，血糖迅速升高，但預(yù)先給不同劑量多糖的小鼠可以顯著抑制血糖升高，增強(qiáng)對(duì)外源性葡萄糖的耐受量，改善小鼠糖耐量有可能是通過(guò)降低機(jī)體吸收葡萄糖的速率或數(shù)量，從而調(diào)節(jié)血糖，這說(shuō)明對(duì)于預(yù)防糖尿病和大血管病變具有重要意義。
2.3 拐棗多糖對(duì)腎上腺素引起高血糖小鼠血糖的影響
ALX 是一種常用的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Ⅱ型糖尿病的物質(zhì)，其致病原因在于它能破壞小鼠的胰島 細(xì)胞導(dǎo)致氧化應(yīng)激而升高血糖，通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射3% ALX，對(duì)小鼠胰島 細(xì)胞進(jìn)行特殊的破壞，從而減少胰島素的來(lái)源使小鼠血糖升高，小鼠進(jìn)食量、飲水量、尿量顯著增加，體形明顯消瘦，行動(dòng)遲緩，且血糖11.0 mmol/L，說(shuō)明 ALX 誘導(dǎo)糖尿病模型成功，對(duì)糖尿病小鼠血糖的結(jié)果見(jiàn)表 4。小鼠通過(guò)連續(xù)灌胃拐棗多糖治療 28 d 后空腹血糖均明顯升高，低劑量組小鼠血糖為25.39 mmol/L，空白對(duì)照組小鼠血糖為6.40 mmol/L，兩者之間存在極顯著差異(p0.01)，而ALX 模型小鼠血糖為29.10 mmol/L，與低劑量組之間相比無(wú)顯著差異(p0.05)，與中、高劑量組之間相比成顯著差異(p灌胃給藥二甲雙胍28 d 后小鼠的血糖為16.47 mmol/L，拐棗多糖中劑量治療小鼠的血糖值與模型組相比有顯著性差異(p0.05)，而高劑量組血糖為16.74 mmol/L，與模型組比較血糖明顯降低，有極顯著性差異(p0.01)。以上結(jié)果表明，拐棗多糖對(duì)糖尿病模型小鼠具有明顯的降血糖作用，且高劑量組降血糖效果最好，與二甲雙胍組無(wú)顯著差異(p0.05)。Gong 等研究表明，馬齒莧粗多糖可顯著降低DM小鼠的空腹血糖濃度和提高血漿胰島素水平;Li 等報(bào)道黃芪多糖可顯著降低血糖水平，提高血漿胰島素濃度，降低 細(xì)胞凋亡率，也可改善胰島素與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，增強(qiáng)對(duì)胰島素敏感性，有效保護(hù)和修復(fù)胰島細(xì)胞，還可通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝酶活性來(lái)降低血糖水平。
2.5 拐棗多糖對(duì)糖尿病小鼠糖化血紅蛋白的影響
糖化血紅蛋白是人體血液中HbAlc與葡萄糖通過(guò)非酶促的緩慢結(jié)合所形成的一種血紅蛋白組分，與血糖濃度成正比，所以檢測(cè)血中 HbAlc水平可以直觀的反映出血糖水平，能更好地反映機(jī)體糖代謝的情況。小鼠口服拐棗多糖后結(jié)果見(jiàn)表5。在0 d時(shí)小鼠血糖高、中劑量組與模型組和對(duì)照組相比均成極顯著差異(p0.01)，低劑量組與模型組和對(duì)照組相比均成極顯著差異(p小鼠口服高、中劑量拐棗多糖7 d 后血液中 HbAlc 含量顯著下降到10.95%和11.47%，與模型組的12.51%比較具有顯著性差異(p0.05)，低劑量組小鼠的HbAlc含量與模型組比較無(wú)顯著性差異(p0.05)，而口服二甲雙胍的小鼠 HbAlc 含量明顯降低到10.24%，其高劑量效果與二甲雙胍組無(wú)顯著差異(p0.05)。這說(shuō)明拐棗多糖能刺激ALX致糖尿病小鼠現(xiàn)代食品科技Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.111剖學(xué)觀察正常組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑、有光澤，染色均勻，內(nèi)膜下細(xì)胞排列整齊，中層平滑肌和彈力層完整。ALX 誘導(dǎo)糖尿病模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜可見(jiàn)大量的內(nèi)皮細(xì)胞增生、脂質(zhì)沉積，中膜平滑肌細(xì)胞增生、排列紊亂，有些部位鈣化明顯。二甲雙胍組和拐棗多糖高劑量組相比模型組內(nèi)膜較完整平坦，內(nèi)皮黏附及浸潤(rùn)于內(nèi)膜的單核細(xì)胞明顯少于模型組，內(nèi)膜增厚明顯輕于模型組，說(shuō)明拐棗多糖可以調(diào)節(jié)降低糖尿病小鼠血脂，對(duì)糖尿病小鼠的血管并發(fā)癥有一定的改善作用。的胰島細(xì)胞的再生并釋放胰島素，使胰島素分泌增多，降低糖尿病小鼠HbAlc水平，有效調(diào)節(jié)和改善糖代謝水平，也可能調(diào)節(jié)糖代謝酶的活性，降低小鼠血清葡萄糖水平，降低肝磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸脂酶的活性，顯著提高血清丙酮水平及肝糖原含量，增加葡萄糖的利用，所以通過(guò)用拐棗多糖來(lái)降低 HbAlc水平，能有效降低心血管病發(fā)病率，對(duì)控制和防治糖尿病具有重要意義。糖尿病小鼠在拐棗多糖高、中、低劑量的干預(yù)下，血脂代謝發(fā)生了變化，變化結(jié)果見(jiàn)表6。正常組小鼠TC、TG 和HDL 分別為1.20、0.66 和0.44 mmol/L，糖尿病模型小鼠在連續(xù)灌胃多糖治療7 d 后TC、TG和HDL 分別為1.60、1.20 和0.63 mmol/L，均顯著升高(p0.05)，而HDL 由0.50 mmol/L 顯著降低到0.35mmol/L(p0.05)。模型組與二甲雙胍組比較，TC、TG 和HDL 均有明顯升高(p0.05)，分別為1.38、1.07 和0.49 mmol/L。給藥四周后，高劑量組與糖尿病模型組比較小鼠的TC、TG 和HDL，分別為1.32、0.80和0.40 mmol/L 兩者有極顯著性差異(p0.01)，其對(duì)糖尿病模型小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用與二甲雙胍組相當(dāng)，兩組的TC、TG 及HDL 含量均無(wú)顯著性差異(p高劑量多糖口服治療后各小鼠LDL 逐漸恢復(fù)到0.46 mmol/L，與正常和模型組比較均具有顯著性差異(p0.05)。對(duì)各組小鼠主動(dòng)脈病理變化進(jìn)行解。
2.6 拐棗多糖對(duì)糖尿病模型小鼠體重的影響
在ALX誘導(dǎo)糖尿病模型組小鼠成功后3~4 d 內(nèi)出現(xiàn)飲水、進(jìn)食及尿量明顯增加，體質(zhì)量略有下降，活動(dòng)減少等表現(xiàn)，灌胃拐棗多糖后糖尿病小鼠體重變化結(jié)果。正常組小鼠隨時(shí)推移體重由19.02 g 逐漸增加到25.40 g，而造模成功后的各組小鼠體形則明顯消瘦，體重逐漸減少到16.05 g ，與模型組相比，在給藥第28 d后，拐棗多糖治療組小鼠體重逐漸恢復(fù)增加，高劑量多糖治療后小鼠體重由18.30 g增加到18.40 g，小鼠活動(dòng)與精神狀況逐漸好轉(zhuǎn)，多糖高劑量與二甲雙胍之間的治療效果相似。這可能是ALX誘導(dǎo)后糖尿病小鼠受到胰島素缺乏的原因，小鼠不能充分利用葡萄糖產(chǎn)生的能量，破壞了糖代謝的正常過(guò)程，而不能提供生理需要的能量，引起致脂肪和蛋白質(zhì)分解加速，消耗過(guò)量，體重逐漸下降。而通過(guò)拐棗多糖的治療，小鼠體重逐漸恢復(fù)。
2.7 拐棗多糖對(duì)小鼠急性毒理試驗(yàn)
小鼠口服(灌胃)急性毒性預(yù)試驗(yàn)中，一次性灌服拐棗多糖劑量分別為10000、20000、40000、60000mg/kgbw，給藥后籠邊觀察7 d，小鼠給藥后各組外觀毛色光亮，無(wú)興奮、不安、竄動(dòng)、跳躍、豎毛、流淚、流涎、凸眼、扭體反應(yīng)現(xiàn)象，給藥后攝食、進(jìn)水、大小便等均無(wú)明顯異常。觀察期間未出現(xiàn)死亡和異常反應(yīng)，小鼠活動(dòng)自如，LD50 未能測(cè)出。并對(duì)小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死進(jìn)行心、肝、肺、脾、腎、子宮、睪丸、卵巢、腸等重要臟器病理檢查，均未出現(xiàn)出血、充血、水腫、滲出、潰瘍、穿孔、胸腔、腹腔、心包膜無(wú)積液等明顯病理變化。根據(jù)毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，LD5010000 mg/kgbw(灌胃)屬于無(wú)毒性物質(zhì)，本研究中一次性灌服拐棗多糖最大劑量為60000 mg/kg bw，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果說(shuō)明拐棗多糖對(duì)小鼠安全無(wú)毒。
3 結(jié)論
本文研究拐棗多糖對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠血糖和血脂的影響。以腹腔注射ALX建立小鼠糖尿病模型，連續(xù)灌胃給藥28 d，研究HAP對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等指標(biāo)的影響。研究表明，糖尿病模型組小鼠體重減少，而飲食量、飲水量及排尿量增加，符合糖尿病三多一少的癥狀，且胰島細(xì)胞破損明顯，導(dǎo)致糖尿病模型組小鼠的FBG明顯高于正常對(duì)照組;經(jīng)過(guò)28 d的灌胃治療，拐棗多糖治療組不同程度降低了小鼠的FBG，高劑量治療組的降糖效果顯著;拐棗多糖處理降低了小鼠HbA1c含量，并作用效果與二甲雙胍組接近;與正常組相比，糖尿病模型組小鼠 TC和TG濃度顯著升高，HDL的含量有所下降，與糖尿病模型組相比，拐棗多糖各劑量組均能使糖尿病小鼠血清中G、TC含量降低，同時(shí)提高HDL含量，說(shuō)明能夠改善糖尿病小鼠血脂代謝紊亂的情況;拐棗多糖高劑量治療后主動(dòng)脈內(nèi)膜相比模型組較完整平坦，內(nèi)皮黏附及浸潤(rùn)于內(nèi)膜的單核細(xì)胞明顯較少，內(nèi)膜增厚明顯輕于模型組，說(shuō)明拐棗多糖可以調(diào)節(jié)降低糖尿病小鼠血脂，對(duì)糖尿病小鼠的血管并發(fā)癥有一定的改善作用，對(duì)治療高脂血癥、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等方面是具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景的，有望成為一種新型調(diào)節(jié)血脂的保健食品。本研究中一次性灌服拐棗多糖最大劑量為 60000 mg/kg bw，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明拐棗多糖對(duì)小鼠安全無(wú)毒。正常組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)推移增加迅速，與正常組相比較，造模成功后的各組小鼠體形則明顯消瘦，體重逐漸變輕。表明拐棗多糖具有很好的促進(jìn)糖尿病小鼠體重恢復(fù)的作用。雖然拐棗多糖的降血糖作用不如口服降血糖藥二甲雙胍那么強(qiáng)，但其作用比較溫和，不會(huì)出現(xiàn)二甲雙胍那樣強(qiáng)烈的低血糖反應(yīng)也是其突出的優(yōu)點(diǎn)，用來(lái)開(kāi)發(fā)無(wú)毒無(wú)副作用的降糖替代藥物具有重要意義。
討論利用黃連生產(chǎn)的下腳料提取黃連素工藝
黃連素俗稱小檗堿是從中藥黃連中提取的一種重要的生物堿，作為中藥黃連的有效成分應(yīng)用極為廣泛。傳統(tǒng)用于治療急性結(jié)膜炎，急性細(xì)菌性痢疾，急性腸胃炎和口瘡等均有較好療效. 新的研究成果發(fā)現(xiàn)黃連素還兼有鎮(zhèn)靜催眠、擴(kuò)張冠狀血管、解熱降溫、降低血壓和抗心律失常等新功效。黃連素目前還不能人工全合成生產(chǎn)，主要是利用中藥黃連、黃柏、南天竹、三顆針等草本或木本植物作為原料生產(chǎn)提取。隨著生態(tài)環(huán)境保護(hù)的強(qiáng)化，需要減少對(duì)黃柏等木本植物的砍伐，使其原料更加稀少而黃連的生產(chǎn)對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境要求極為嚴(yán)苛，并且生長(zhǎng)速度較為緩慢。但目前仍然主要使用其干燥的根莖，對(duì)其生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的大量莖葉、根須等下腳料大多拋棄未予利用。李英明等人研究表明，黃連根莖、葉柄和根須的紅外光譜圖均具有明顯的指紋圖譜。即黃連的葉柄、根須等黃連生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的下腳料可作為提取黃連素的原材料。目前報(bào)道的從黃連中提取黃連素工藝多種多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)，本著簡(jiǎn)單有效、綠色環(huán)保和實(shí)用便捷的理念，本文試驗(yàn)采用相對(duì)便于工業(yè)化生產(chǎn)的醇提法。
1 材料
( 1) 原料與試劑: 黃連下腳料( 利川佛寶山) ，黃連素標(biāo)準(zhǔn)品( 購(gòu)買) ，95%乙醇，37%HCl，冰醋酸等均為分析純。( 2) 儀器: 粉碎機(jī)( 天津市泰斯儀器有限公司) 、電熱恒溫浴鍋( 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠) 、SHB - 3 行循環(huán)水式多用真空泵( 鄭州杜甫儀器廠) 、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE - 52A( 上海亞榮生化儀器廠) 、布氏漏斗、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、滴定管、移液器、圓底燒瓶、三角瓶、電子天平等。
2 工藝流程與黃連素產(chǎn)品的檢測(cè)
2. 1 流程
黃連葉柄根須粉碎后置入回流燒瓶中加入提取劑，在一定溫度下回流提取一定時(shí)間后會(huì)取出上清液，再加入提取劑回流提取三次，合并三次浸提液減壓過(guò)濾，濾液回收乙醇直到棕紅色糖漿狀濃縮液，加入1%醋酸加熱溶解，抽濾以除去不溶物，然后于濾液中滴加濃鹽酸至溶液渾濁為止，放置到有黃色針狀體析出，抽濾，結(jié)晶用蒸餾水洗滌兩次得黃連素粗品，粗品經(jīng)重結(jié)晶、干燥得精品。
2. 2 黃連素的鑒定
( 1) 取樣品50mg，加蒸餾水5ml，緩慢加熱使之溶解，加NaOH試液2 滴，顯橙色，溶液經(jīng)放冷后，過(guò)濾，濾液中加丙酮數(shù)滴，即產(chǎn)生黃色的渾濁液或沉淀，與標(biāo)準(zhǔn)品一致。
( 2) 取樣品少許，加H2SO42ml 溫?zé)嶂寥芙?，再加漂白粉少許，振蕩后即產(chǎn)生櫻桃紅色，與標(biāo)準(zhǔn)品一致。
( 3) 于樣品的水溶液中，滴加濃硝酸數(shù)滴，溶液產(chǎn)生黃綠色硝酸小蘗堿沉淀，與標(biāo)準(zhǔn)品一致。經(jīng)上述方法鑒別可以認(rèn)為提取物為黃連素。
2. 3 黃連素含量的測(cè)定
2. 3. 1 黃連素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
精密稱取黃連素對(duì)照品10. 00mg 于100ml 容量瓶中，加量無(wú)水乙醇在水浴上加熱溶解。放冷至室溫，用無(wú)水乙醇定容至刻度。再精密吸取1. 00mL 上述溶液加入10mL 容量瓶中用無(wú)水乙醇定容至刻度。搖勻，備用。其溶液濃度為0. 010mg /mL。
2. 3. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別精密量取濃度為0. 010mg /mL 的黃連素標(biāo)準(zhǔn)溶液1. 0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL、5. 0mL，置于5 個(gè)10mL 容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，混勻。標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 10 - 3mg /mL，以乙醇為空白，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，測(cè)得在350nm 為最大吸光度。以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程: ( y = 0. 0559x + 0. 0096，r = 0. 9995) ; 表略。
2. 3. 3 樣品檢測(cè)樣品溶液的濃度配制同標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制一樣，濃度為0. 010mg /ml，再分別稀釋濃度為3 10 - 3mg /mL。測(cè)得樣品的吸光度。根據(jù)樣品的吸光度和直線回歸方程算得試樣中的含量。
3 討論
3. 1 乙醇濃度
按照固液比為1: 15 的比例分別以60%，70%，80%，90%乙醇在70℃下操作，測(cè)定提取液中黃連素的平均含量依次為2. 15%，2. 29%，2. 54%和2. 31%; 可見(jiàn)乙醇提取劑以80%為最佳。
3. 2 固液比
分別取固液比1∶ 6，1∶ 8，1∶ 10，1∶ 12; 以80% 乙醇為提取劑在70℃下操作，測(cè)定提取液中黃連素的平均含量依次為2. 39%，2. 55%，2. 41% 和2. 38%; 可見(jiàn)在同一條件下固液比以1 ∶ 8 為最佳。
3. 3 提取時(shí)間
取固液比1∶ 8以80%醇為提取劑在同一操作條件下分別提取1. 0，1. 5，2. 0，2. 5 小時(shí)，測(cè)定提取液中黃連素的平均含量依次為1. 95%，2. 01%，2. 41% 和2. 21%; 可見(jiàn)在同一條件下提取時(shí)間以2. 0 小時(shí)為最佳。
3. 4 提取溫度
取固液比1 ∶ 8 以80% 醇為提取劑分別在60℃，70℃，80℃，90℃下按同一操作條件提取，測(cè)定提取液中黃連素的平均含量依次為2. 01%，2. 15%，2. 42% 和2. 36%; 可見(jiàn)在同一操作條件下提取溫度以80℃為最佳。
4 結(jié)論
( 1) 本文采用的試驗(yàn)工藝雖綠色環(huán)保便捷有效但存在提取效率不夠高，而且溶劑回收任務(wù)重，工業(yè)化生產(chǎn)能耗大。
( 2) 本試驗(yàn)利用黃連生產(chǎn)下腳料提取黃連素目的在于擴(kuò)大黃連素生產(chǎn)原料資源減少對(duì)野生植物資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)有利于生態(tài)環(huán)境保護(hù)與建設(shè)。
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